La cloroquina 316

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Genotoxicidad Laboratorio de la División de Toxicología, CSIR-Instituto Central de Investigación de Drogas (CDRI), Lucknow 226 001, India Recibido el 28 de noviembre de 2012 5 revisado de febrero de 2013 aceptado el 19 de de febrero de 2013 Editor Académico: Mats Wahlgren Derechos de Autor 2013 Shrawan Kumar Mishra et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo la licencia de Creative Commons. que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que la obra original es debidamente citados. Resumen El presente estudio tiene por objeto averiguar el efecto protector de la quercetina sobre la hepatotoxicidad resultante por cloroquina fármaco antipalúdico utilizado habitualmente (CQ). ratones albinos suizos fueron administrados con diferentes cantidades de CQ que van desde equivalente terapéutica humana de 360 ​​mg de peso corporal / kg. Se observó generación estadísticamente significativa de especies reactivas de oxígeno, toxicidad en el hígado, y el estrés oxidativo. Nuestra observación de alteraciones en los parámetros bioquímicos fue fuertemente apoyada por la medición en tiempo real PCR de la expresión de ARNm de las enzimas bioquímicas clave implicados en la toxicidad hepática y el estrés oxidativo. Sin embargo, la hepatotoxicidad observada y acompañando el estrés oxidativo siguiente patrón específico programa de dosis de administración de CQ con poco o ningún efecto aparentemente en dosis terapéutica, mientras que tienen efectos graves en dosis más altas. Además, la prueba quercetina, un flavonoide antioxidante, contra la hepatotoxicidad inducida por CQ y encontramos resultados alentadores como la quercetina fue capaz de reducir drásticamente el estrés oxidativo y la hepatotoxicidad resultante a dosis más altas de la administración de CQ. En conclusión, nuestro estudio sugiere fuertemente la administración conjunta de flavonoide antioxidante como la quercetina, junto con CQ para la terapia contra la malaria. Esto es particularmente importante cuando CQ se administra como tratamiento profiláctico a largo plazo para la malaria como la exposición crónica ha demostrado que resulta en el nivel de dosis más alta de fármaco en el cuerpo. 1. Introducción La cloroquina 7-cloro-4- (4-dietilamino-1-metilbutilamino) quinolina, CQ es un compuesto antimalárico derivado de 4-aminoquinolina. Aparte de ser un antimalárico establecido, CQ también encuentra uso como un fármaco anti-inflamatorio en el tratamiento de la artritis reumatoide 1 3, lupus eritematoso discoide 4. 5, y la hepatitis amebiana 6. A pesar de los informes de resistencia a la cloroquina en muchas partes del mundo, todavía se utiliza como primera línea de terapia contra la malaria en muchos países en desarrollo debido a que es fácilmente disponible y barato. Sin embargo, a pesar de ser eficaz en la gama de enfermedades, su uso fue siempre bajo escrutinio ya que tiene estrecho margen de seguridad y ha mostrado amplia gama de efectos secundarios incluyendo cardiaca y trastornos neurológicos, retinopatía y ototoxicidad 7 23. La quercetina se ha aplicado para la terapia clínica debido a sus múltiples actividades farmacológicas, tales como la supresión de la proliferación celular, la protección de la oxidación de LDL, la prevención de la agregación plaquetaria, y la inducción de la apoptosis 24. Se ha planteado la hipótesis de que estos efectos protectores de la quercetina puede ser debido a una amplia variedad de mecanismos, incluyendo la reducción del estrés oxidativo por radicales libres, la promoción de la supervivencia celular mediante la modulación de señales intracelulares, o la disminución de la toxicidad de los xenobióticos y carcinógenos mediante la regulación de la expresión génica 25. Cuantitativa en tiempo real PCR es una técnica poderosa que se ha utilizado ampliamente para la detección de los cambios de expresión génica más finos a nivel de transcripción. El presente estudio utiliza alta eficiencia LightCycler 480 (Roche Diagnostics) en tiempo real la tecnología de PCR junto con análisis enzimático bioquímica convencional para evaluar los detalles mecanicistas de la hepatotoxicidad inducida por cloroquina. Los objetivos específicos de este estudio fueron, por tanto, (1) para investigar el efecto de la administración de cloroquina dependiente de la dosis en el hígado de los ratones de laboratorio albinos suizos (2) para evaluar la eficacia de la quercetina, un flavonoide antioxidante, para contrarrestar la hepatotoxicidad mediada por CQ ( 3) para comprender el mecanismo de hepatotoxicidad CQ mediada y su posible mejorar por la quercetina en la expresión génica y el nivel de actividad enzimática. 2. Materiales y Métodos 2.1. Kits de productos químicos para la estimación de la alanina aminotransferasa (ALT) y aspartato aminotransferasa (AST) se obtienen a partir de Beckman Coulter, Irlanda. Todos los demás productos químicos y bioquímicos eran de grado analítico y menos que se indique de otro modo se obtuvieron de Sigma Chemical Company (St. Louis, MO, EE. UU.). 2.2. El tratamiento de animales suiza ratones machos albinos (20 g) se adquirieron de la división de los animales de laboratorio del instituto. El comité de ética institucional para el uso de animales de laboratorio aprobó el estudio. Los animales se mantuvieron en la casa de los animales en condiciones normales de temperatura y humedad (temperatura:.. Mg de peso corporal / kg de quercetina Todos los animales fueron sacrificados por dislocación cervical después de 24C congelador 2.3 Extracción de sangre, suero Bioquímica, y la estimación de.. intracelulares especies reactivas del oxígeno (ROS) se extrajo sangre hacia fuera de cada animal mediante punción cardíaca y se dejan reposar durante 30 software (Becton Dickinson, EE. UU.), y se calcularon las diferencias en la intensidad de fluorescencia media (MFI). 2.4. los exámenes histopatológicos de secciones de hígado tejidos del hígado fijadas se lavaron durante la noche, deshidratados a través de alcoholes graduados, y embebidos en parafina. las secciones seriadas de 5E) para el examen histológico de acuerdo con nuestros estudios anteriores 29. 33. 2.5. Examen bioquímico del tejido del hígado Las muestras de tejido de hígado congelado se pesaron rápidamente antes de ser homogeneizadas en tampón de fosfato potásico 50 mM enfriado con hielo () que contiene 1C. Los sobrenadantes se separaron y se usaron para ensayos de actividad enzimática. 2.6. Medición de la peroxidación lipídica Nivel (LPO) La peroxidación lipídica se estimó utilizando el método de Ohkawa et al. 34. Un 10 nm frente al blanco de control. 2.7. Catalasa (CAT) de medición de actividad de catalasa se midió por el método descrito por Sinha 35. En resumen, mezcla de ensayo que consiste en proteína de 0,01 mol / min / mg. 2.8. Actividad superóxido dismutasa (SOD) Medición superóxido dismutasa (SOD) se midió espectrofotométricamente a 570 nm. La actividad de la SOD se calculó en unidades / ml / min. 2.9. Se determinó la glutatión reductasa actividad de la reductasa (GR) de medición de actividad de glutatión en el homogeneizado de tejido midiendo la disminución en la absorbancia a tampón de fosfato de 340M (pH 7,0) se mezclaron vigorosamente antes de medir la absorbancia. La actividad enzimática se expresa en la proteína nmol / min / mg. 2.10. Glutatión peroxidasa Actividad (GPX) actividad de la peroxidasa de glutatión medición se determinó de acuerdo con el método de Wendel 38. La mezcla de reacción que contiene 48s intervalo y se expresa en unidades / mg de proteína. 2.11. Glutathione El contenido total de (GSH) Estimación GSH se estimó por el método de Ellman 39. En breve, cada reacción consiste en 0,6 M de fosfato de sodio, la fracción de sobrenadante, y 0,2 nm, y se calculó la actividad sobre la base de una curva de calibración estándar trazados usando GSH. 2.12. Proteína La proteína de medición se ensayó por el método de Lowry et al. 40, con albúmina de suero bovino como estándar. 2.13. Aislamiento de ARN y los tejidos del hígado congelado en tiempo real cuantitativa análisis de PCR de diferentes grupos de tratamiento de ratones fueron utilizados para el aislamiento de ARN usando el reactivo TRIZOL. ARNm se transcribe de forma inversa de acuerdo con la manufactureC. Se usó agua como el molde para amplificaciones de control negativo se incluyen con cada serie de PCR. Todas las reacciones se realizaron por duplicado en cada placa de 96 pocillos. Los datos fueron analizados utilizando el software Roche LightCycler 480, y Cp se calculó por el segundo método de máxima Derivados. La cantidad de ARNm diana se examinó y se normalizó para el ARNm del gen GAPDH. La relación de expresión relativa de un gen diana se calculó como se describe por Pfaffl 41, en base a tiempo real eficiencia de la PCR. Los pares de cebadores se enumeran en la Tabla 1 y se diseñaron con el software Lasergene. Los resultados reportados se obtuvieron de al menos tres repeticiones biológica y PCR experimentos se repitieron al menos dos veces. Tabla 1: Lista de los cebadores utilizados en la reacción de PCR en tiempo real. 2.14. Análisis estadístico Los datos existentes se expresaron como el error estándar media de las medias (S. E.M.). Grupo de medios se compararon mediante análisis unidireccional de la varianza (ANOVA) con la prueba de Newman-Keuls análisis posterior. Las diferencias en los datos obtenidos se consideraron estadísticamente significativas cuando el valor era menor que 0,05. Todo el análisis estadístico se realizó mediante el uso de Prism versión 5 (GraphPad Software Inc. EE. UU.). 3. Resultados 3.1. Se evaluó especies reactivas del oxígeno (ROS) Nivel y Suero biomarcadores de hepatotoxicidad El potencial de la cloroquina para generar estrés oxidativo en dosis diferentes en términos de la producción intracelular de ROS y sus consecuencias después de la administración de quercetina. células mononucleares de sangre periférica aisladas de diferentes grupos de animales se marcaron con H2DCFDA, y aumento en la intensidad media de fluorescencia se analizó mediante citometría de flujo. Un 3,45 veces de incremento aproximado de la DCF oxidado significa pico, indicativo de mayor H 2 O 2 contenido, se observó en el grupo de 4 animales tratados con 2000 mg / kg de cloroquina en comparación con el control no tratado de animales del Grupo 1. La quercetina cotratamiento (Grupo 5), sin embargo, fue eficaz en la reversión de completa de nivel de ROS como intensidad media de fluorescencia de Grupo 5 animales fue similar a la de grupo no tratado 1 Animales (Figuras 1 (a) y 1 (b)). nivel de ROS no fue modificado con respecto al grupo 1 en todos los demás grupos. Un aumento significativo en la actividad de la ALT sérica () después de dosis de cloroquina se observó con el aumento de la actividad en proporción directa con CQ dosificación. naturaleza hepatoprotector de la quercetina se observa como Grupo 5 animales mostraron niveles séricos de ALT, AST nivel comparativamente más cerca de la del Grupo 1 de control. Además, no parece tratamiento de la quercetina como tal (Grupo 6) para influir en la ALT sérica y los niveles de AST (Figuras 2 (a) y 2 (b)). Figura 1: Detección de citometría de flujo de la generación de ROS. (A) animales del Grupo 1 que eran controles no tratados se comparan con el grupo de 4 animales que fueron dosificados con peso 2000 mg / kg de. dosis de CQ. la generación de ROS se midió en términos de intensidad de fluorescencia media. Figura 2: Efecto de la dosis de cloroquina y su protección mediante tratamiento quercetina sobre los biomarcadores séricos de hepatotoxicidad (a) de la alanina aminotransferasa (ALT) y (b) de la aspartato aminotransferasa (AST). Los datos se expresan como medias ()). 3.2. Peroxidación lipídica Figura 3 muestra los niveles de malonaldehído (MDA) un producto secundario de la peroxidación de lípidos en homogeneizados de hígado tratados con diferentes dosis de CQ y sus consecuencias después de la administración quercetina. Grupo 4. Figura 3: Las alteraciones en la actividad de la peroxidación lipídica (experimentos separados). Los datos se expresan como medias ()). 3.3. De glutatión total contenido Figura 4 muestra el contenido de GSH en los animales tratados con CQ y quercetina. En comparación con los controles no tratados de GRUPO6) no cambió el contenido de glutatión. Figura 4: Las alteraciones de glutatión reducido (GSH) contenido (experimentos separados). Los datos se expresan como medias ()). 3.4. La actividad de las enzimas antioxidantes (SOD, CAT, GPx y GR) Figuras 5. 6. 7. 8 y demuestran la actividad de SOD, CAT, GPX y GR, respectivamente. Grupo 4 animales tratados con 20.005) muestra una mejora en el perfil antioxidante como la actividad de SOD, CAT, GPx y GR de Grupo 5 es muy similar a la de grupo no tratado 1. Figura 5: en la superóxido dismutasa SOD) actividad (alteración (experimentos separados ). Los datos se expresan como medias ()). Figura 6: La alteración en la catalasa (CAT) actividad (experimentos separados). Los datos se expresan como medias ()). Figura 7: Alteración de la glutatión peroxidasa (GPx) actividad (experimentos separados). Los datos se expresan como medias ()). Figura 8: Alteración de la glutatión reductasa (GR) actividad (experimentos separados). Los datos se expresan como medias ()). 3.5. El análisis histopatológico Figura 9 muestra imágenes representativas de hematoxilina y eosina sección de ratones hígado manchado expuesta a la cloroquina. Grupo 4 ratones muestran que el daño hepático significativo según lo exhibido por los órganos de eosinófilos pronunciadas y infilteration linfocitos. tratamiento quercetina (Grupo 5) es capaz de reducir las lesiones hepatocíticas incurridos debido al tratamiento con cloroquina en 2000 mg de peso corporal / Kg. No se observaron cambios significativos en los otros grupos de estudio. Figura 9: evaluación histopatológica de la toxicidad en el hígado murino CQ: (a) Control sin tratar (b) tratados con 360 mg / kg de quercetina. Los cuadros son representativos de tres conjuntos diferentes de experimentos. 3.6. Resultados cuantitativos de PCR figuras 10. 11. 12. y 13 muestran el nivel de ARNm transcripción de SOD, CAT, GPx y GR genes, medido en términos de valor Cp. Grupo 4 ratones muestran disminución en el nivel de mRNA de todos los cuatro enzimas antioxidantes en el estudio. perfil de expresión de Grupo 2, Grupo 5 y del Grupo 6 animales fue similar a la de control no tratado de la expresión del transcrito Grupo 1. mRNA de genes antioxidantes se reduce en caso de Grupo 4 cuando se compara con el Grupo 1 control. Los valores en las figuras 10. 11. 12. y 13 indican que el cambio veces en la expresión de ARNm con respecto al grupo de control 1. Figura 10: Medición de PCR cuantitativa de los cambios en el nivel de ARNm transcrito del gen SOD. Los valores son indicativos de la diferencia en el cambio de ARNm pliegue de los grupos tratados con respecto al control no tratado del Grupo 1. Figura 11: Medición cuantitativa por PCR de los cambios en el nivel de transcripción de ARNm del gen CAT. Los valores son indicativos de la diferencia en el cambio de ARNm pliegue de los grupos tratados con respecto al control no tratado del Grupo 1. Figura 12: Medición cuantitativa por PCR de los cambios en el nivel de transcripción de ARNm del gen GPx. Los valores son indicativos de la diferencia en el cambio de ARNm pliegue de los grupos tratados con respecto al control no tratado del Grupo 1. Figura 13: Medición cuantitativa por PCR de los cambios en el nivel de transcripción de ARNm del gen GR. Los valores son indicativos de la diferencia en el cambio de ARNm pliegue de los grupos tratados con respecto al control no tratado del Grupo 1. El presente estudio evalúa la dosis 4. Discusión efecto hepatotóxico específica de CQ y su posible protección por un flavonoide quercetina a base de hierbas en ratones albinos suizos. aminotransferasa alanina en suero (ALT) y aspartato aminotransferasa (AST) se consideran como biomarcadores de daño hepático 42, por lo tanto, una elevación estadísticamente significativa () de sus niveles en los Grupos 3 y 4 animales indica hepatotoxicidad CQ-inducida en estas dosis. animales del Grupo 2 tratados con dosis equivalente terapéutico no mostraron ninguna elevación de ALT y AST nivel en comparación con los controles no tratados de Grupo 1. El aumento en el nivel de estas enzimas en el suero puede ser debido a la lesión de los tejidos con la subsiguiente liberación de las enzimas en la circulación del hígado tejidos dañados 42. Sin embargo, nuestros resultados están de acuerdo con otros estudios 13. 14 que habían informado dosis similares de CQ ser hepatotóxicos. Además, el aumento de nivel en sangre ROS (especies reactivas de oxígeno) que se observa para animales del Grupo 4 en comparación con los controles del Grupo 1. Esta generación de ROS CQ mediada puede ser responsable de daño oxidativo en este grupo de animales. Nuestra observación de la mejora de los niveles de ROS por la quercetina en el grupo 5 animales indica la actividad de eliminación de radicales libres de este flavonoide de origen vegetal. Ya que varios estudios han indicado el desarrollo del estrés oxidativo siguiente toxicidad hepática 43. 44, se analizó el nivel de actividad y la expresión de mRNA de los principales sistemas antioxidantes del organismo tras la administración de cloroquina. Lipid peroxidación de los ácidos grasos insaturados es un índice usado comúnmente de aumento de estrés oxidativo y la posterior citotoxicidad. Se cree que la peroxidación lipídica se inicia por el ataque de un radical libre en el ácido graso o de la cadena lateral de acilo graso de cualquier entidad química 45 y se considera como uno de los mecanismos básicos de daños en los tejidos causados ​​por los radicales libres. En nuestro estudio, se observó un aumento significativo en la concentración de MDA, un producto secundario de LPO, en el hígado de Grupo 3 y Grupo 4 ratones tratados con 1000 y 2000 mg / Kg de peso corporal. de la cloroquina, respectivamente. GSH se sintetiza en el citoplasma de las células del hígado y luego se distribuye a través del sistema circulatorio / transporte en diferentes órganos y compartimentos subcelulares 46. GSH desempeña un papel crucial tanto en ROS barrido y la desintoxicación de drogas y productos químicos. GSH reacciona directamente con ROS y metabolitos electrófilos, la protección de los grupos tiol esenciales de la oxidación. Por lo tanto, la perturbación en el estado redox de GSH no sólo puede perjudicar la defensa celular contra compuestos tóxicos, pero también dan lugar a estrés oxidativo mejorada y la lesión del tejido 46. Se aprecia una disminución significativa en el nivel de GSH en el Grupo 4 animales en comparación con el grupo 1 de control. Sin embargo, cuando se complementa con 50 mg de peso corporal / kg. de la quercetina, que era capaz de recuperar la pérdida de contenido de GSH a casi normal. GR y GPx son las principales enzimas que metabolizan los fármacos de fase II-glutatión-dependiente. Se encontró una disminución en los niveles de estas dos enzimas en el Grupo 4 animales en comparación con los controles de grupo 1. La disminución de GR junto con disminución del contenido de GSH sugiere una disminución en la relación total de GSH / GSSG, un índice de estrés oxidativo del tejido 47 . 48. SOD acelera la conversión del radical superóxido () a H 2 O 2 31, mientras que el CAT y GPX limpian H 2 O 2 y la convierten en agua 49. 50. En este estudio, CQ en la dosis más alta de Grupo 4 muestra disminución significativa en la actividad de SOD y CAT en comparación con los animales del Grupo 1. Disminución de la actividad de SOD en el Grupo 4 animales puede ser una consecuencia de la disminución de la síntesis de novo de proteínas enzimáticas que se caracterizan por la reducción en el nivel de transcrito de ARNm o inactivación irreversible de las proteínas de la enzima de aumento de la producción de radicales libres resultante de metabolismo cloroquina. Jenkins y Goldfarb han informado de que la disminución de la actividad de SOD refleja el estrés oxidativo 51. Por otra parte, la disminución de la actividad de CAT en el Grupo 4 ratones pueden ser debido al exceso de anión radical superóxido como consecuencia de una reducción en la actividad de SOD. Informes anteriores han indicado también que la alta producción de anión superóxido radicales inhibe la actividad de CAT 52. De nuevo, la disminución en la actividad de GPX observó en este estudio podría ser el resultado de la disminución del contenido de GSH, un sustrato de medida en GPX reacción catalizada. Sin embargo terapéutico grupo de dosis equivalente de animales del Grupo 2 no mostró ninguna generación de ROS apreciable o disminución en el nivel de las enzimas antioxidantes, lo que sugiere que la cloroquina en dosis terapéutica es bastante segura en el hígado (como ALT sérica y los niveles de AST también no son perturbados a esta dosis ) y no causar daño oxidativo. La expresión de genes es una herramienta útil para estudiar el mecanismo de fármaco toxicidad / inducido por productos químicos, y ha sido ampliamente utilizado en el pasado para delinear detalles más finos de la toxicología mecanicista 53. Una ganancia o pérdida de la expresión del ARNm de un gen particular es un indicador de la profunda acompaña entorno celular de ese gen. Un análisis en tiempo real qPCR de la expresión de mRNA de las principales enzimas antioxidantes se lleva a cabo en este estudio. Nuestra investigación revela disminución en el ARNm nivel de transcripción de las principales enzimas antioxidantes (SOD, CAT, GPX y GR) en animales del Grupo 4 con respecto a la de los controles del grupo 1. Esta disminución en el nivel de expresión podría ser el efecto de la generación de ROS y / o el desarrollo del estrés oxidativo que resulta finalmente en la disminución de la síntesis de la enzima 54. En conclusión, se presenta una pérdida en la actividad y la reducción de la transcripción de ARNm para las principales enzimas antioxidantes en ratones tratados con CQ dependientes de la dosis. Además, también a la conclusión de que la quercetina, un flavonoide a base de plantas, tiene el potencial de invertir de nuevo la toxicidad inducida por CQ y el estrés oxidativo probablemente a través de barrido de la generación de radicales libres. Sin embargo, creemos que nuestro estudio se centra más en los parámetros de estrés oxidativo y, por lo tanto, es muy probable que podamos haber perdido muchas otras vías pertinentes que podrían ser importantes en la comprensión de los detalles de la mecánica más finos de la hepatotoxicidad inducida por CQ. Un transcriptómica y proteómica de perfiles más amplio a través de microarrays y la electroforesis en gel de 2D va a resolver este propósito y, por lo tanto, sugiere fuertemente. Conflicto de intereses Los autores declaran que no tienen ningún conflicto de intereses. Agradecimientos Este trabajo fue apoyado por una beca del CSIR, India Red del Plan de NWP0034. Autores S. K. Mishra y P. Singh son los destinatarios de Investigación superiores de becas de Consejo Indio de Investigación Médica y el Departamento de Biotecnología, India, respectivamente. El documento lleva CDRI Comunicación no. 7767. Referencias E. O. Tito, los desarrollos recientes en la comprensión de la farmacocinética y mecanismo de acción de la cloroquina, Monitoreo Terapéutico de Drogas. vol. 11, no. 4, pp. 369379, 1989. Ver en Google Académico Visión en Scopus P. Augustijns, P. Geusens y N. Verbeke, niveles de cloroquina en la sangre durante el tratamiento crónico de pacientes con artritis reumatoide, European Journal of Clinical Pharmacology. vol. 42, no. 4, pp. 429433, 1992. Ver en Google Académico Visión en Scopus P. Augustijns y N. Verbeke, propiedades farmacocinéticas estereoselectiva de cloroquina y de-etil-cloroquina en los seres humanos, Farmacocinética Clínica. vol. 24, no. 3, pp. 259269, 1993. Ver en Google Académico Visión en Scopus S. Krishna y N. J. 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